Microfluidique : tout savoir sur ces labos qui tiennent dans une goutte

Développée depuis les années 1960, dans le sillage de la miniaturisation de l’électronique, la microfluidique a bénéficié des avancées dans la compréhension des phénomènes physiques à petites échelles. Elle permet aujourd’hui de concevoir des unités d’analyse sur des plaquettes de la taille d’une puce électronique, et ainsi de mieux étudier le comportement des cellules de certains organes et les solutions métabolisées. Avec le développement de la recherche sur les gènes, cette technologie ouvre de nouvelles perspectives. S’appuyant sur le contrôle de gouttelettes au sein d’un réseau, elle offre l’opportunité d’analyser un grand nombre d’essais dans un laps de temps plus court. Mais aussi de tracer, isoler et interagir plus efficacement sur les échantillons étudiés.

La microfluidique est un domaine des sciences et technologies portant sur les écoulements et leur mise en œuvre dans des réseaux de canaux à l’échelle du micron. Nous pouvons vulgairement comparer cette science à de la plomberie miniature. Son essor est considérable dans de nombreux domaines industriels comme les biotechnologies, l’analyse, la synthèse chimique et le diagnostic clinique. La microfluidique se situe à la croisée de la biologie, de la physique, de la chimie et de l’ingénierie. Elle tire profit des progrès de la microélectronique, ainsi que des phénomènes physiques qui ont lieu à ces échelles par miniaturisation.

1. Principes

Un laboratoire miniature

Le concept de miniaturisation est, depuis plus d’un demi-siècle, un paradigme dominant dans presque toutes les disciplines scientifiques et technologiques. L’exemple le plus marquant est celui de la révolution des semiconducteurs catalysés, avec l’invention, en 1958, du premier circuit intégré, une innovation motivée en large partie par la réduction de la taille et du coût des composants électroniques. De même, le développement des technologies microfluidiques depuis vingt-cinq ans s’est concentré sur le transfert et l’ajout des bénéfices de la miniaturisation dans la biologie et la chimie.

Nous devons la première application de la microfluidique à Siemens, au début des années 1950 : une tête d’imprimante à jet d’encre utilisant des tubes très fins pour transporter l’encre. Mais c’est l’essor de la microélectronique, qui permet d’intégrer des microstructures telles que des pompes, des vannes et des canaux, qui va contribuer à la naissance des laboratoires sur puce. En 1979, le premier instrument de chromatographie en phase gazeuse miniaturisé est développé par des chercheurs de Stanford. Il faudra attendre dix ans pour que soient commercialisées des applications de la microfluidique par Agilent Technologies ou encore Caliper Life Sciences, qui utilisent l’électrophorèse capillaire pour les analyses biochimiques.

La microfluidique fait un bond en avant à partir des années 2000, notamment grâce au soutien de la Defense advanced research project agency (Darpa), une agence du département américain de la défense spécialisée dans l’innovation de rupture, en quête de solutions miniaturisées portables pour la détection d’agents impliqués dans la guerre biologique. Des chercheurs d’Harvard mettent ainsi au point une méthode permettant de s’affranchir des techniques de lithographie traditionnelles sur silicium, jusqu’alors très coûteuses. C’est le début de la démocratisation de la microfluidique et de sa croissance exponentielle. Alors que les technologies microfluidiques étaient utilisées pour automatiser des essais biologiques relativement simples (« immunoassay », chimie du sang, gaz du sang), de nouvelles applications vont permettre par exemple le séquençage de nouvelle génération (NGS) ou des tests diagnostics au lit du patient (point-of-care). Aujourd’hui, la microfluidique est utilisée pour l’analyse génétique, l’électrophorèse capillaire, l’amplification d’ADN, la biologie cellulaire, la protéomique, le diagnostic, la recherche de médicaments, la synthèse de molécules ou de nanomatériaux…

La recherche en microfluidique a été accélérée par le fait que les processus physiques sont plus facilement contrôlables (dans le temps et dans l’espace) quand les dimensions sont réduites à l’échelle du micron. Cette miniaturisation permet en outre de manipuler de petits volumes de fluide, d’améliorer les performances analytiques, de réduire la taille des instruments, d’avoir une capacité haut débit d’analyse, de faciliter l’intégration de différentes fonctionnalités sur une même « puce » et d’exploiter le comportement de fluides atypiques pour contrôler des espèces chimiques ou biologiques.

Toutefois, définir les dispositifs microfluidiques uniquement par la réduction d’échelle est peu satisfaisant. Il est plus approprié de les décrire en termes de performance et de comportement. En effet, certaines caractéristiques critiques sont dues à la physique particulière, notamment au niveau du transfert de chaleur et de masse, qui s’exerce à ces échelles. Premièrement, les volumes associés aux environnements microfluidiques imposent que le transport de masse soit presque toujours dominé par la diffusion. Cela signifie que le mélange se produit de manière contrôlable et que les régimes d’écoulement laminaire sont entièrement développés.

Les écoulements dans un réseau microfluidique peuvent se modéliser en utilisant la notion de résistance hydraulique par analogie avec un réseau électrique de résistance. La pression est associée à la tension, le débit au courant électrique.

De plus, les grands rapports surface-volume typiques des environnements à micro-échelle garantissent une homogénéité thermique à travers le système et un transfert de chaleur rapide entre le dispositif et le fluide contenu. Cela entraîne plusieurs conséquences. D’abord, un écoulement fluidique prévisible et laminaire avec des gradients à grande vitesse et des effets interfaciaux dominants (permettant la manipulation contrôlée des courants de fluides, les effets inertiels sur les particules sans turbulences fluides et la génération d’émulsions monodisperses).

Les phénomènes de diffusion au sein des réseaux microfluidiques sont bien maîtrisés. Ils permettent de développer des applications associées telles que des micromélangeurs ou des générateurs de gradients de concentration.

Ensuite, des volumes de fluide compartimentés (gouttes), qui peuvent contenir des entités uniques et concentrer les produits de réaction. Enfin, des conditions de réaction uniformes pour contrôler les réactions en masse ou sur les surfaces. Dans cette définition large, les systèmes microfluidiques se divisent en deux sous-classes, qui fonctionnent de différentes manières et avec des caractéristiques et des avantages variables. On peut définir les systèmes microfluidiques comme étant monophasiques (fonctionnant avec un fluide uniquement aqueux ou non aqueux) ou multiphases (fonctionnant avec au moins deux phases fluidiques en contact, par exemple aqueuses-fluorées ou non).

2. Conception

La connaissance des matériaux

Le type de matériau utilisé est essentiel dans le développement d’applications microfluidiques. Toutefois, chaque système microfluidique doit être conçu pour une utilisation finale. Le développement de méthodes de prototypage rapide permettant de réaliser simplement des puces dans des élastomères tel que le polydiméthylsiloxane (PDMS) a catalysé la croissance de la recherche en microfluidique au début des années 1990. Outre son faible coût, ce matériau possède de nombreux avantages pour le prototypage d’expériences en biologie. Il est transparent, ce qui permet l’observation du contenu des canaux au microscope. Il est également flexible, ce qui a permis à l’équipe de Stephen Quake, universitaire américain spécialisé en microfluidique, d’intégrer des vannes et des pompes dans les circuits microfluidiques. Enfin, il est perméable aux gaz, permettant ainsi d’effectuer des cultures cellulaires en contrôlant la quantité de gaz à travers le PDMS. Cette caractéristique est indispensable pour réaliser des organes sur puce.

Représentation du fonctionnement d'un foie simulé grâce à la microfluidique. En reconstituant des tissus dans des systèmes miniaturisés, on obtient des modèles d'organes simplifiés afin notamment de développer des médicaments.

Les organes sur puce progressent grâce aux avancées sur les cellules souches et aux cocktails biologiques. Prochains objectifs : passer à plusieurs tissus et créer un système dans lequel tous les organes humains sont connectés par des capillaires sanguins microfluidiques.

Cependant, le PDMS est mal adapté à la production de masse. À l’inverse, les substrats en verre ou en silicium sont robustes, mais nécessitent des procédés de fabrication sophistiqués, dont le coût et l’accès sont prohibitifs. Fait intéressant, le silicium et le verre deviennent des matériaux importants pour les dispositifs nanofluidiques comprenant des canaux à allongement élevés ou des électrodes intégrées. Une alternative bien connue est l’utilisation de thermoplastiques tels que le plexiglas (PMMA), le polystyrène (PS) ou encore les copolymères oléfines cycliques (COC) qui sont plus chers à mettre en œuvre. Cela dit, ces méthodes de fabrication limitent les dispositifs microfluidiques aux formats planaires quasi 2D. L’augmentation de la résolution des imprimantes 3D et la baisse du prix des équipements grand public permettent aujourd’hui d’appliquer la fabrication additive aux dispositifs microfluidiques. L’impression directe accélérera le prototypage des dispositifs et offrira aux scientifiques un outil accessible et stimulant pour exprimer leur créativité. Les principales applications de la microfluidique sont dans les sciences analytiques. Malgré son attrait évident, la microfluidique monophasique connaît des limites, notamment au niveau de la dispersion de Taylor, source de contamination. D’autres méthodes de manipulation des fluides, telles que la gestion des gouttes, sont nécessaires pour atteindre le potentiel de miniaturisation des systèmes microfluidiques.

3- Évolution

La science des gouttes

Ces dernières années ont été marquées par un fort engouement pour le développement et l’application de systèmes microfluidiques multiphasiques en chimie et en biologie. Cette microfluidique s’inspire de la science des émulsions, dans laquelle un fluide porteur (une huile par exemple) disperse une solution aqueuse pour former des gouttelettes. Elle tire parti de l’immiscibilité pour créer des volumes discrets et isolés, qui résident et se déplacent dans un flux continu. Chaque goutte peut ainsi être utilisée comme un microréacteur séparé des parois de l’appareillage et des autres gouttes.

Du fait de la réduction des dimensions du système à des dizaines ou des centaines de micromètres, la tension interfaciale et les forces de surface entre les fluides immiscibles dominent les forces gravitationnelles et les forces normalement visqueuses ou inertielles de l’écoulement. De quoi permettre la rupture contrôlée des jets de fluide en gouttelettes de diamètres très homogènes (identiques aux dimensions du canal porteur) ou la production de gouttelettes à des cadences supérieures à 1 000 gouttes par seconde (1 000 fois plus rapides que celles des tests en microplaques). Ainsi, un contrôle indépendant, en termes de taille, d’emplacement et de composition chimique, peut être effectué sur chaque gouttelette. Mais l’utilisation de gouttelettes permet avant tout de réaliser une gamme d’opérations unitaires intégrées à haut débit. Celles-ci comprennent la génération de gouttelettes, le mélange à l’intérieur des gouttes, la détection, la fusion de gouttes, l’injection dans les gouttes, le tri, le fractionnement, la dilution, le stockage – sur puce ou en dehors de la puce – et l’échantillonnage.

La microfluidique comprend différents procédés aboutissant à un large panel d'applications. Les combinaisons sont nombreuses afin d'offrir un contrôle très précis du fluide à analyser.

On peut en intégrer plusieurs sur une puce pour réaliser des opérations complexes. Une des particularités des gouttes, c’est qu’elles permettent d’isoler des molécules, des particules ou des cellules dans ces compartiments miniaturisés. En subdivisant un échantillon avec une concentration appropriée de cellules ou de molécules en gouttelettes, on peut encapsuler une seule entité dans chaque volume isolé avec des occupations de gouttelettes qui obéissent à la loi de Poisson. étant donné leur faible taille, chaque goutte est un réservoir homogène, il n’y a plus de dispersion, la diffusion y est quasi instantanée, ce qui permet de suivre des réactions chimiques ou biologiques rapides, de manière reproductible.

De la même manière que pour les systèmes monophasiques, où le matériau était prépondérant, la formulation, c’est-à-dire la composition physico-chimique des gouttes et de l’huile qui l’entoure, est un des éléments essentiels qui caractérise les systèmes multiphasiques. On a souvent recours à des tensioactifs pour occuper la surface des gouttes, soit pour les stabiliser et éviter qu’elles ne fusionnent entre elles, soit pour augmenter ou diminuer les échanges de molécules entre les gouttes.

Par conséquent, il n’est pas surprenant que les systèmes microfluidiques à base de gouttelettes soient de plus en plus utilisés comme environnements dans lesquels effectuer une gamme de tests biologiques et chimiques de façon efficace, intégrée et rapide.

4- Applications

Des analyses toujours plus précises

Le mélange rapide, la chimie multi-étapes et les étapes de séparation intégrées font de la microfluidique multiphasique une plate-forme puissante pour synthétiser une grande variété de nanomatériaux, dont la forme, la taille et la composition peuvent être contrôlées avec une précision inégalée. Les dispositifs microfluidiques permettent un suivi de réaction en continu, ce qui conduit à un contrôle supérieur du processus et est donc préférable d’un point de vue industriel. En effet, la production de gouttelettes hautement homogènes constitue un tremplin important pour la synthèse de microparticules complexes. Par exemple, les gouttelettes produites par des écoulements diphasiques peuvent être solidifiées par une réticulation chimique ou physique pour former des particules sphériques ou allongées.

Ces particules peuvent encapsuler des fluides intelligents, c’est-à-dire capables de changer de propriété lorsqu’ils sont soumis à des champs électriques ou magnétiques. Elles sont notamment utilisées dans les amortisseurs de certaines marques de voitures. Elles peuvent également renfermer des encres chargées pour permettre de faire des affichages électrophorétiques utilisés dans les liseuses de type Kindle. Enfin, du fait de leur uniformité, de leur comportement constant, contrôlé et prévisible, les particules synthétisées dans des systèmes microfluidiques multiphasiques ouvrent la voie à la micro-encapsulation pour des applications thérapeutiques, cosmétiques ou encore les additifs alimentaires. Elles sont utilisées alors comme vecteurs pour transporter les composants actifs vers leur cible.

Les systèmes robotisés, dont se sert l’industrie pour le criblage en microplaques, ont permis une réduction de la taille des échantillons analysés jusqu’à des volumes de l’ordre du microlitre et des cadences d’environ un test par seconde avec des plaques de microtitration. Mais, cette technologie est sur le point d’atteindre ses limites. Les changements d’échelle liés à la diminution des volumes ou à l’augmentation des cadences font apparaître des barrières intrinsèques. D’une part, les systèmes mécaniques tels que les robots ne sont pas facilement miniaturisables. D’autre part, la manipulation des liquides à des échelles submillimétriques est limitée par l’évaporation relativement rapide des liquides (eau ou solvants) et les effets de surface. Dès lors, la microfluidique en goutte se présente comme une alternative pour le criblage ultra-haut débit, soit 1 000 échantillons par seconde. Cette méthode peut porter sur des bibliothèques de composés pharmaceutiques pour établir des candidats médicaments, des anticorps thérapeutiques, des micro-organismes ou des enzymes avec des activités nouvelles ou plus performantes en vue de développer des procédés de biotransformation. Il faut noter cependant que, bien que ces systèmes soient puissants en laboratoire, ils nécessitent des opérateurs qualifiés et ne sont pas encore assez robustes ou évolutifs pour répondre aux exigences strictes de l’industrie pharmaceutique.

Dans les systèmes microfluidiques, la capacité à isoler des molécules ou des cellules dans des compartiments de petites tailles constitue un facteur clé permettant des mesures à l’échelle de la cellule ou de la molécule unique. Aussi, la compartimentation est maintenant le fondement de nombreuses technologies émergentes. Ainsi, la PCR en goutte, dite ddPCR (digital droplet PCR), se révèle être une technologie d’avenir pour la détection précoce et le suivi des cancers à partir du sang du patient et s’inscrit dans la biopsie liquide. Cette technique permet d’atteindre une sensibilité extrême : jusqu’à 1 brin d’ADN muté sur 10 000 brins sauvages. Elle est la première application commerciale aboutie de la microfluidique en goutte.

Le contrôle des gouttes permet d'effectuer une amplification en chaîne par polymérase (PCR) et de numériser les résultats obtenus. Après la phase d'échantillonnage, des fragments ADN sont encapsulés au sein de gouttes et isolés. La cible nucléique est alors amplifiée et la phase de détection produit un signal binaire qui sera ensuite analysé.

Les différences au niveau unicellulaire sont cruciales dans le développement, la différenciation, la signalisation et la maladie. Par exemple, l’hétérogénéité génomique est d’une importance majeure dans le traitement du cancer, car elle peut provoquer la sélection de cellules résistantes. La microfluidique en goutte permettant la compartimentation non seulement des cellules individuelles mais aussi des génomes uniques est donc une technique idéale pour étudier la génomique unicellulaire à haut débit. Plusieurs études ont récemment montré l’intégration de méthodes de séquençage de nouvelle génération grâce à la microfluidique en goutte. Elles ont toutes utilisé des codes-barres d’acide nucléique (introduits directement dans la gouttelette, sur des billes fonctionnalisées, ou encapsulés dans des billes d’hydrogel) pour réaliser le séquençage à l’échelle de la cellule unique. Un certain nombre de start-up se sont déjà positionnées sur cette application génomique.

Pour élucider les mécanismes qui gouvernent une grande variété de processus chimiques et biologiques, il est souvent nécessaire de surveiller et de caractériser précisément leur dynamique temporelle. Indépendamment des échelles temporelles associées à de tels processus (allant de quelques millisecondes à des heures ou des jours), les systèmes microfluidiques reposant sur les gouttelettes peuvent servir à extraire de telles informations et ont déjà démontré leur utilité pour approfondir certains problèmes fondamentaux en chimie et biologie. Un exemple de processus biologique est la croissance de populations de micro-organismes. L’analyseur haut débit a été développé pour suivre leur croissance.

Le MilliDrop Analyser est un instrument de culture et d'analyse haut débit de micro-organismes. Chaque goutte est analysée pour déterminer des cinétiques de croissance.

Il manipule des gouttes légèrement plus grosses que celles utilisées en microfluidique, permettant de cultiver les micro-organismes directement dans les gouttes et de suivre les cinétiques de croissance sur plusieurs jours. Les cultures peuvent être mono ou polymicrobiennes. La dynamique de croissance peut être utilisée pour étudier la réponse, l’adaptation et la résistance des micro-organismes aux antibiotiques ou à l’invasion d’autres micro-organismes. L’encapsulation permet de mettre en présence des espèces différentes et d’observer des effets collectifs et les interactions sur de très petites échelles.

5. Perspectives

L’atout majeur de la génomique

La microfluidique monophasique est une technologie mature que l’on retrouve aujourd’hui dans un grand nombre d’instruments d’analyse, du glucomètre au cytomètre en flux. La microfluidique en goutte est également mature, mais au niveau académique. Un bon indicateur est la quantité d’articles scientifiques publiés à ce jour, focalisés non plus sur des développements technologiques mais sur des applications. Toutefois, la production et la mise en œuvre de ces systèmes microfluidiques dans la plupart des laboratoires impliquent un grand degré d’artisanat, beaucoup de savoir-faire et de connaissances empiriques.

Les premiers produits commerciaux intégrant la microfluidique de goutte qui ont vu le jour ces dernières années sont des outils pour la génomique. Il y a fort à parier que de la même manière que les besoins de calculs ont été le moteur de la croissance exponentielle de l’industrie des semiconducteurs, la génomique ou encore le diagnostic seront les moteurs de croissance de la microfluidique.

De plus en plus d’instruments microfluidiques seront bientôt disponibles. Tout comme dans nos smartphones, cette technologie sera invisible, et tous les aspects techniques, chimiques et physiques qui y sont associés seront transparents.

Mais il faut garder à l’esprit que les outils microfluidiques ne sont pas nécessairement appropriés dans de nombreuses situations et que la capacité à identifier les bonnes applications, qui trouvent un bénéfice immédiat dans le contrôle microfluidique, est essentiel pour favoriser une adoption plus large de la technologie. Comme le dit le professeur David Weitz de l’université d’Harvard : « La microfluidique est une merveilleuse solution qui cherche encore ses meilleurs problèmes ». ?